Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光 货号15259-AAT Bioquest荧光染料

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Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光    货号15259 货号 15259 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 400 Tests 价格 3924
Ex (nm) 571 Em (nm) 585
分子量 溶剂
产品详细介绍

简要概述

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

现有的NADP / NADPH测定通过吸收在UV范围内进行。该测定具有低灵敏度和高干扰。这种Amplite™荧光总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显著降低了生物样品的干扰。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光    货号15259

Amplite™荧光总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(10 nM;图1)中检测少至1皮摩尔的NADP(H)。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。红色发射时间越长,生物样品的自发荧光干扰越小。

 

适用仪器


光吸收酶标仪  
吸收: 576 ± 5 nm
推荐孔板: 透明底板

产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)

加入NADPH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟–2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物:

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):

3.1将10μLNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液中以产生10M(10pmol / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADPH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定:

4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(最佳540 / 590nm)下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2:对于NADP / NADPH比率测量,建议使用Cat#15264。

注意3:对于基于细胞的NADP / NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(Cat#20012)裂解细胞。

 

数据分析

 

空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光    货号15259

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在黑色96孔板中用Amplite™荧光总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。在孵育30分钟(n = 3)时可以检测到低至10nM(1pmol /孔)的NADPH,而NADH没有响应。

 

参考文献

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说明书
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光.pdf

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