Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法* 货号36373-AAT Bioquest荧光染料

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Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*

Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*

货号 36373 存储条件 Multiple
规格 1 plate 价格 3924
Ex (nm) 571 Em (nm) 584
分子量 溶剂
产品详细介绍

简要概述

Screen Quest 荧光ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种优化的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的激活。该测定基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间固定数目的抗体结合位点的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 荧光cAMP分析试剂盒提供了检测腺苷酸环化酶活性的灵敏方法。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,它消除了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光HRP底物来定量HRP活性。形成的荧光产物与HRP-cAMP偶联物的活性成比例。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。

 

适用仪器


荧光酶标仪  
激发: 540nm
发射: 590nm
cutoff: 570nm
推荐孔板: 黑色孔板(试剂盒自带)

产品说明书

样品实验方案

简要概述

  1. 准备样品
  2. 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
  3. 在室温下孵育5-10分钟
  4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
  5. 在室温下孵育2小时
  6. 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
  7. 添加100 µL /孔的Amplite Red
  8. 在室温下孵育15至60分钟
  9. 检测Ex / Em = 540/590 nm时的荧光增加

 

溶液配制

储备溶液配制

1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。 注意:应将未使用的cAMP储备溶液(100 µM)等分并保存在-20℃下。

2. HRP-cAMP偶联物原液(50X):将55 µL(#36373)或550 µL(#36374)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。

3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。

4. Amplite Red储备液(200X):将50 µL(#36373)或500 µL(#36374)的DMSO加入到Amplite Red(组分G)的小瓶中。 注意:0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。

 

工作溶液配制

1. HRP-cAMP工作溶液:在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用。

2. Amplite Red工作溶液:向10 mL底物缓冲液(组分I)中加入50 µL Amplite Red储备溶液(200X)和11.5 µL 3%H2O2(组分F)注意:Amplite Red工作溶液不稳定,请立即使用。

 

实验步骤

1.准备样品

1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。

1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

 

2.cAMP测定

2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。

2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。

2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育2小时。

2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。

2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液,并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。

2.6通过使用荧光酶标仪(顶部读取模式),检测Ex / Em = 540/590 nm(截止570 nm)处的荧光增加。

 

图示

Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*   货号36373

图1.使用Screen Quest 荧光ELISA cAMP测定试剂盒在带有Gemini酶标仪的黑色96孔板上测量cAMP剂量反应。

 

 

参考文献

A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198

Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)

Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852

Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798

Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29

The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75

cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741

A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849

Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707

Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203

说明书
Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*.pdf

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