Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

	货号	15263	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	250 Tests	价格	4584
	Ex (nm)	571	Em (nm)	585
	分子量		溶剂
	产品详细介绍

简要概述

Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

这种Amplite 荧光NAD / NADH比率分析试剂盒为敏感检测NAD，NADH及其比例提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了来自生物样品的干扰。 无需从样品混合物中纯化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可以通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（最大Ex / Em = 540/590nm）或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。 该试剂盒提供NAD和NADH提取缓冲液，以及细胞裂解缓冲液，方便您使用。 它经常用于从细胞裂解物中测定NAD / NADH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的NAD/NADH检测试剂盒。 

产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室温下孵育15分钟

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反应混合物

在室温下孵育15分钟至2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将30μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入970μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL30M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品添加到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1.实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADH标准品从0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>300μM，终浓度）可能由于NADH传感器（非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

3.4对于NADH提取（NADH）：将25μLNADH提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNAD提取溶液（组分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

对于NAD提取（NAD）：将25μLNAD提取溶液（组分E）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH提取溶液（组分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

对于总NAD和NADH：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意1：根据需要准备细胞或组织样本。 NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

注意2：在健康的哺乳动物细胞中，与NADH相比，NAD更多，因此可以简单地使用总NAD和NADH减去NAD来计算NADH的量。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将75μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，使得总NADH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 典型数据如图1所示（总NAD和NADH与NAD或NADH提取物）。

图1.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在96孔黑色板中用Amplite™NAD / NADH比率测定试剂盒测量总NADH和NAD及其提取物剂量响应。 用或不用NADH或NAD提取溶液处理25μL等量的NAD和NADH 15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在加入75μLNADH反应混合物后30分钟，在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）获得信号。 从具有NADH反应的那些孔的值中减去空白信号。 （注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的）。

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细菌样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

试剂应用文献

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation

Authors: Yang, Fei and Heit, Caitlin and Inglis, Debra L
Journal: Fermentation (2017): 61

Prediction of intracellular metabolic states from extracellular metabolomic data
Authors: Aurich, Maike K and Paglia, Giuseppe and Rolfsson, Ottar and Hrafnsdóttir, Sigrún and Magnúsdóttir, Manuela and Stefaniak, Magdalena M and Palsson, Bernhard O and Fleming, Ronan MT and Thiele, Ines
Journal: Metabolomics (2015): 603–619

Bio-inspired NADH regeneration by carbon nitride photocatalysis using diatom templates
Authors: Liu, Jian and Antonietti, Markus
Journal: Energy & Environmental Science (2013): 1486–1493

GAPDH is critical for superior efficacy of female bone marrow-derived mesenchymal stem cells on pulmonary hypertension
Authors: Tan, Rubin and Li, Jiansha and Peng, Xiaochun and Zhu, Liping and Cai, Lei and Wang, Tao and Su, Yuan and Irani, Kaikobad and Hu, Qinghua
Journal: Cardiovascular research (2013): 19–27

Nucleoside reverse transcriptase inhibitors induce a mitophagy-associated endothelial cytotoxicity that is reversed by coenzyme Q10 cotreatment
Authors: Xue, Stephen Y and Hebert, Valeria Y and Hayes, Danicia M and Robinson, Corie N and Glover, Mitzi and Dugas, Tammy R
Journal: toxicological sciences (2013): 323–334

Identification of an annonaceous acetogenin mimetic, AA005, as an AMPK activator and autophagy inducer in colon cancer cells
Authors: Liu, Yong-Qiang and Cheng, Xin and Guo, Liang-Xia and Mao, Chan and Chen, Yi-Jie and Liu, Hai-Xia and Xiao, Qi-Cai and Jiang, Sheng and Yao, Zhu-Jun and Zhou, Guang-Biao
Journal: PloS one (2012): e47049

参考文献

A metabolomic study of the effect of Candida albicans glutamate dehydrogenase deletion on growth and morphogenesis
Authors: Ting-Li Han, Richard D Cannon, Sandra M Gallo, Silas G Villas-Boas
Journal: NPJ biofilms and microbiomes (2019): 13

Growth suppression by altered (p) ppGpp levels results from non-optimal resource allocation in Escherichia coli
Authors: Manlu Zhu, Xiongfeng Dai
Journal: Nucleic acids research (2019)

Roles of Nmnat1 in the survival of retinal progenitors through the regulation of pro-apoptotic gene expression via histone acetylation
Authors: Hiroshi Kuribayashi, Yukihiro Baba, Toshiro Iwagawa, Eisuke Arai, Akira Murakami, Sumiko Watanabe
Journal: Cell death & disease (2018): 891

Xylan supplement improves 1, 3-propanediol fermentation by Clostridium butyricum
Authors: Waraporn Apiwatanapiwat, Pilanee Vaithanomsat, Warunee Thanapase, Khanok Ratanakhanokchai, Akihiko Kosugi
Journal: Journal of bioscience and bioengineering (2018)

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124–133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

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