mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯 货号1180-AAT Bioquest荧光染料

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mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯

mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯

mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯    货号1180 货号 1180 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 1 mg 价格 3732
Ex (nm) 481 Em (nm) 663
分子量 747.91 溶剂 DMSO
产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号:1180

产品名称:mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯

规格:1mg

储存条件:-15℃干燥

保质期:12个月

 

产品物理化学光谱特性

分子量:747.91

外观:固体

溶剂:DMSO

 

产品介绍

mFluor Blue 660染料可用488 nm的蓝色激发光充分激发。它具有巨大的斯托克斯位移,发射波长约为660 nm。mFluor™Blue 660染料是水溶性的,用mFluor™Blue 660染料制备的蛋白质结合物在488 nm处被激发,产生红色荧光。mFluor™Blue 660染料和缀合物是用于流式细胞仪检测的出色的蓝色荧光试剂。与RPE相比,mFluor™Blue 660染料具有更高的光稳定性,使其易于用于荧光成像应用,而由于RPE缀合物的快速光漂白,很难将RPE缀合物用于荧光成像应用。它也是用于光谱流式细胞仪的独特荧光染料,因为很少有具有这种特殊光谱特征的现有染料。

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参考文献

A Comprehensive Workflow for Applying Single-Cell Clustering and Pseudotime Analysis to Flow Cytometry Data.
Authors: Melsen, Janine E and van Ostaijen-Ten Dam, Monique M and Lankester, Arjan C and Schilham, Marco W and van den Akker, Erik B
Journal: Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) (2020)

Acquisition of High-Quality Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Fox, Amy and Dutt, Taru S and Karger, Burton and Obregón-Henao, Andrés and Anderson, G Brooke and Henao-Tamayo, Marcela
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e74

HTLV infected individuals have increased B-cell activation and proinflammatory regulatory T-cells.
Authors: Kjerulff, Bertram and Petersen, Mikkel Steen and Rodrigues, Candida Medina and da Silva Té, David and Christiansen, Mette and Erikstrup, Christian and Hønge, Bo Langhoff
Journal: Immunobiology (2020): 151878

High-Dimensional Data Analysis Algorithms Yield Comparable Results for Mass Cytometry and Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mayer, Johannes U and Old, Samuel and Hermans, Ian F and Irish, Jonathan and Price, Kylie M
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mehta, Palak and Harmos, Phoebe and Schmidt, Alfonso J and Chappell, Sally and Price, Kylie M and Hermans, Ian F and Ronchese, Franca and le Gros, Graham and Mayer, Johannes U
Journal: eLife (2020)

Multispectral Flow Cytometry: Unaddressed Issues and Recommendations for Improvement.
Authors: Parks, David R
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Panel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometry.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Pellefigues, Christophe and Mayer, Johannes U and Small, Sam J and Jaimes, Maria C and Price, Kylie M
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e70

Phenotypic Analysis of the Mouse Hematopoietic Hierarchy Using Spectral Cytometry: From Stem Cell Subsets to Early Progenitor Compartments.
Authors: Solomon, Michael and DeLay, Monica and Reynaud, Damien
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Spectral flow cytometry-Quo vadimus?
Authors: Robinson, J Paul
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2019): 823-824

Time-Delayed Integration-Spectral Flow Cytometer (TDI-SFC) for Low-Abundance-Cell Immunophenotyping.
Authors: Hu, Wenting and Soper, Steven A and Jackson, J Matt
Journal: Analytical chemistry (2019): 4656-4664

说明书
mFluor Blue 660琥珀酰亚胺酯.pdf

mFluor UV460 抗人 CD43 抗体 *HI161* 货号104310Y0-AAT Bioquest荧光染料

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mFluor UV460 抗人 CD43 抗体 *HI161*

mFluor UV460 抗人 CD43 抗体 *HI161*

货号 104310Y0 存储条件
规格 100 tests 价格 2880
Ex (nm) 358 Em (nm) 456
分子量 N/A 溶剂
产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号:104310Y0

产品名称:mFluor UV460 抗人 CD43 抗体 *HI161*

规格:100 tests

 

产品介绍

HI161 单克隆抗体与人 CD43 反应,CD43 是一种 95 – 135 kD 的跨膜蛋白,通常位于浆细胞、胸腺细胞、中性粒细胞、骨髓瘤和 T 细胞的表面。在一些生物体中,CD43在下调细胞粘附、促进肿瘤坏死因子的生物合成过程和负调节T细胞增殖方面发挥作用。从研究的角度来看,由于它与重要的大分子/配体(如 EZR)相关,因此具有生物学意义。 CD43 是一种相当少见的抗体靶标,在过去十年中发表的文章仅仅 5000 篇。尽管如此,CD43 已广泛用于免疫学研究,在流式细胞仪应用中经常用作区分细胞类型的表型标记。该抗体通过亲和层析纯化并与 mFluor™ UV460 偶联(ex/em = 358/456 nm)。它与 355 nm 激光和 447/60 nm 带通滤光片兼容(例如,在 Bio-Rad ZE5 细胞分析仪中)。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的mFluor UV460 抗人 CD43 抗体 *HI161*。 

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mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯 货号1168-AAT Bioquest荧光染料

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mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯    货号1168 货号 1168 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 1 mg 价格 3732
Ex (nm) 537 Em (nm) 657
分子量 806.94 溶剂 DMSO
产品详细介绍

简要概述

光谱流式细胞仪的进步已经超越了常规流式细胞仪的应用范围和功能。现在,借助光谱流式细胞仪分析,研究人员和科学家们可以研究越来越多的目标分子。然而,荧光标记和读数的可用性严重限制了光谱流式细胞术的潜力。AAT Bioquest的mFluor™染料专为针对多色流式细胞仪的应用而开发,尤其是用于光谱荧光流式细胞仪。mFluor™Green 630染料可用532 nm的绿色激发光充分激发。它具有巨大的斯托克斯位移,发射约630 nm。mFluor™Green 630染料是水溶性的,用mFluor™Green 630染料制备的蛋白质结合物在532 nm处激发良好,产生红色荧光。mFluor™Green 630染料和结合物是用于流式细胞仪检测的出色绿色激光试剂。与RPE相比,mFluor™Green 630染料具有更高的光稳定性,使其易于用于荧光成像应用,而由于RPE共轭物的快速光漂白,很难将RPE共轭物用于荧光成像应用。它也是用于光谱流式细胞仪的独特荧光染料,因为很少有具有这种光谱特征的现有染料。

产品说明书

样品分析方案 

储备溶液配制

1.蛋白质储备液(溶液A)

将100 µL反应缓冲液(例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液)与900 µL目标蛋白溶液(例如抗体,如果可能,蛋白浓度> 2 mg / mL)混合,得到1 mL蛋白质标记储备液。
注意:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0,请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。
注意:蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须使用pH 7.2-7.4的1X PBS进行透析,以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。
注意:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,结合效率会大大降低。为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.染料原液(溶液B)

在mFluor™Green 630 SE小瓶中加入无水DMSO,制成10-20 mM的储备溶液。通过轻柔移液或涡旋混合均匀。
注意:开始缀合之前,请准备染料储备溶液(溶液B)。立即使用。染料储备溶液的长时间储存​​可能会降低染料活性。避免冻融循环。
注意:收到后,mFluor™Green 630 SE应储存在<-15°C的环境中,并远离光线和湿气。
注意:重新配制的mFluor™染料SE的DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存长达4周。
注意:所需的蛋白质偶联物应在载体蛋白质(例如0.1%牛血清白蛋白)存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度保存。当在2 mM叠氮化钠存在下存储时,结合物溶液可以在4°C下存储两个月而无明显变化。为了更长的存储时间,可以将蛋白结合物冻干或分成单份使用,并保存在≤-60°C下,并避光。

 

操作步骤

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor™Green 630 SE的缀合物而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

确定最佳的染料/蛋白质比率(可选)

每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会不利地影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您使用一系列不同量的标记染料溶液,通过实验确定最佳的染料/蛋白质比率。通常,大多数染料-蛋白质结合物推荐使用4-6种染料/蛋白质。

  1. 以溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的10:1摩尔比为起点:将5 µL染料储备溶液(溶液B,假定染料储备溶液为10 mM)添加到蛋白质瓶中。溶液(95 µL溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL,蛋白质的分子量为〜200KD,则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
    注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10%。
  2. 进行缀合反应。
  3. 重复步骤2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;15:1和20:1。
  4. 使用预制的旋转柱纯化所需的结合物。
  5. 计算上述4种结合物的染料/蛋白质比率(DOS)。
  6. 对以上4种结合物进行功能测试,以确定最佳的染料/蛋白质比率,以扩大标记反应的范围。 
运行缀合反应
  1. 在有效摇动下,将适量的染料储备溶液(溶液B)添加到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中。
    注意:溶液B /溶液的最佳摩尔比由上述步骤确定。如果跳过该步骤(本节:确定最佳的染料/蛋白质比),我们建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。
  2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。 
纯化

以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例。

  1. 准备Sephadex G-25色谱柱。
  2. 将反应混合物(进行共轭反应后的混合物)加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
  3. 样品刚好在顶部树脂表面下方流动时,立即添加PBS(pH 7.2-7.4)。
  4. 向所需样品中添加更多PBS(pH 7.2-7.4),以完成柱纯化。
    注意:为了立即使用,染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并分装多次使用。
    注意:为了长期保存,染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。 

 

参考文献

A Comprehensive Workflow for Applying Single-Cell Clustering and Pseudotime Analysis to Flow Cytometry Data.
Authors: Melsen, Janine E and van Ostaijen-Ten Dam, Monique M and Lankester, Arjan C and Schilham, Marco W and van den Akker, Erik B
Journal: Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) (2020)

Acquisition of High-Quality Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Fox, Amy and Dutt, Taru S and Karger, Burton and Obregón-Henao, Andrés and Anderson, G Brooke and Henao-Tamayo, Marcela
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e74

HTLV infected individuals have increased B-cell activation and proinflammatory regulatory T-cells.
Authors: Kjerulff, Bertram and Petersen, Mikkel Steen and Rodrigues, Candida Medina and da Silva Té, David and Christiansen, Mette and Erikstrup, Christian and Hønge, Bo Langhoff
Journal: Immunobiology (2020): 151878

High-Dimensional Data Analysis Algorithms Yield Comparable Results for Mass Cytometry and Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mayer, Johannes U and Old, Samuel and Hermans, Ian F and Irish, Jonathan and Price, Kylie M
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mehta, Palak and Harmos, Phoebe and Schmidt, Alfonso J and Chappell, Sally and Price, Kylie M and Hermans, Ian F and Ronchese, Franca and le Gros, Graham and Mayer, Johannes U
Journal: eLife (2020)

Multispectral Flow Cytometry: Unaddressed Issues and Recommendations for Improvement.
Authors: Parks, David R
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Panel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometry.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Pellefigues, Christophe and Mayer, Johannes U and Small, Sam J and Jaimes, Maria C and Price, Kylie M
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e70

Phenotypic Analysis of the Mouse Hematopoietic Hierarchy Using Spectral Cytometry: From Stem Cell Subsets to Early Progenitor Compartments.
Authors: Solomon, Michael and DeLay, Monica and Reynaud, Damien
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Spectral flow cytometry-Quo vadimus?
Authors: Robinson, J Paul
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2019): 823-824

Time-Delayed Integration-Spectral Flow Cytometer (TDI-SFC) for Low-Abundance-Cell Immunophenotyping.
Authors: Hu, Wenting and Soper, Steven A and Jackson, J Matt
Journal: Analytical chemistry (2019): 4656-4664

说明书
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Annexin V-mFluor Violet 540标记 货号20082-AAT Bioquest荧光染料

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Annexin V-mFluor Violet 540标记

Annexin V-mFluor Violet 540标记

Annexin V-mFluor Violet 540标记    货号20082 货号 20082 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 100 tests 价格 2604
Ex (nm) 402 Em (nm) 535
分子量 ~36000 溶剂 Water
产品详细介绍

简要概述

Annexin V-mFluor Violet 540标记探针是美国AAT Bioquest研发的用于检测细胞功能的探针,膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。 它们富含真核生物,属于参与信号转导的普遍存在的细胞质蛋白家族。 膜联蛋白V的优先结合配偶体是磷脂酰丝氨酸(PS),其通常保持在细胞膜的内叶(细胞质侧)。 在细胞凋亡中,PS被转移到质膜的外部小叶。 磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示,并且可以在观察到形态变化之前检测到。 我们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功能的工具,旨在通过测量磷脂酰丝氨酸的易位来监测细胞凋亡。

膜联蛋白V结合物在Ca2+存在下与凋亡细胞表面上的PS结合,它也可以通过坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。 因此,我们建议将细胞不可渗透的核染色与膜联蛋白V结合物结合使用,以区分死细胞和凋亡细胞。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Annexin V-mFluor Violet 540标记探针。 

产品说明书

分析方案

概述

用测试化合物(200μL/样品)制备细胞

添加Annexin V结合物测定溶液

室温孵育30-60分钟

用流式细胞仪或荧光显微镜分析

 

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞:

1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液:10mM HEPES,140mM NaCl和2.5mM CaCl2,pH 7.4。

1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间(用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时)以诱导细胞凋亡。

1.3离心细胞,得到1-5×105个细胞/管。

1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中(来自步骤1.1)。

1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选:在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭,用于坏死细胞。

1.6在室温下孵育30至60分钟,避光。

1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前,加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)以增加体积(参见下面的步骤1.8)。

1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度(参见下面的步骤2或3)。

 

2.使用流式细胞仪分析:

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意:粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测,因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而,Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人(见参考文献1和2)。

 

3.使用荧光显微镜分析:

3.1移取步骤1.6的细胞悬液,用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)冲洗1-2次,然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意:对于粘附细胞,建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育(步骤1.6)后,用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)冲洗1-2次,并将膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后,细胞也可以在2%甲醛中固定,并在显微镜下观察。

3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞

 

参考文献

White light-induced cell apoptosis by a conjugated polyelectrolyte through singlet oxygen generation
Authors: Jiamei Liang, Pan Wu, Chunyan Tan, Yuyang Jiang
Journal: RSC advances (2018): 9218–9222

Resources-Application Notes Phenotypic and Epigenetic Mechanism of Action Determinations of Histone Methylase and Demethylase Inhibitors using Digital Widefield Microscopy
Authors: Brad Larson, Peter Banks
Journal: Experimental Biology (2017)

Targeted Magnetic Intra-Lysosomal Hyperthermia produces lysosomal reactive oxygen species and causes Caspase-1 dependent cell death
Authors: Pascal Clerc, Pauline Jeanjean, Nicolas Halalli, Michel Gougeon, Bernard Pipy, Julian Carrey, Daniel Fourmy, Véronique Gigoux
Journal: Journal of Controlled Release (2017)

Detecting Apoptosis, Autophagy, and Necrosis
Authors: Jack Coleman, Rui Liu, Kathy Wang, Arun Kumar
Journal: (2016): 77–92

 

相关产品

产品名称 货号
Annexin V-mFluor Violet 510标记 Cat#20081
Annexin V-mFluor Violet 450标记 Cat#20080
Annexin V-Cy7标记 Cat#20068

说明书
Annexin V-mFluor Violet 540标记.pdf

mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯 货号1151-AAT Bioquest荧光染料

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯

mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯

mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯    货号1151 货号 1151 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 1 mg 价格 2604
Ex (nm) 412 Em (nm) 505
分子量 770.83 溶剂 DMSO
产品详细介绍

简要概述

mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯是美国AAT Bioquest生产的荧光标记染料,mFluor 染料是一系列优秀的荧光标记染料,可以覆盖整个可见光谱。所有mFluor 染料都具有出色的水溶性和大的斯托克斯移位。它们的亲水性使有机溶剂的使用最小化。mFluor 染料主要用于标记多色流式细胞仪应用的抗体。

琥珀酰亚胺基(NHS)酯被证明是用于胺修饰的最佳试剂,因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺表现出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时,需要考虑的因素很少:1)溶剂:在大多数情况下,活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。 2)反应pH:胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应,包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此,胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。 3)反应缓冲液:当使用胺反应试剂时,必须避免使用含有游离胺如Tris和甘氨酸和硫醇化合物的缓冲液。在进行染料结合之前,还必须除去广泛用于蛋白质沉淀的铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)(例如通过透析)。 4)反应温度:大多数缀合在室温下进行。然而,对于特定的标记反应,可能需要升高或降低的温度。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯。 

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产品说明书

操作方法

注意:该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor 450 SE的缀合物开发的。 您需根据您的实际情况而定。

1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):

将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml)混合至100μL,以得到1 mL蛋白质标记原液。

注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

注3:不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白(BSA)抗体或明胶不会被很好的标记,叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,以获得极佳标记结果。

注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,则结合效率会显著降低。为获得极佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

 

2.准备染料储备溶液(溶液B):

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B),及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免冻融循环。

 

3.确定最佳染料/蛋白质比例(可选):

注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常,对于大多数染料 – 蛋白质缀合物,推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中。蛋白质溶液(95μl溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10%。

3.2运行缀合反应(参见下面的步骤4)。

3.3重复#3.2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;分别为15:1和20:1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比(DOS)。

3.6检测上述4种结合物,确定最佳的染料/蛋白质比例,以扩大标记反应。

 

4.运行结合反应:

4.1有效加入适量的染料储备溶液(溶液B)到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中晃动。

注意:溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3,我们建议使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

 

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 – 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物(直接从步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4向所需样品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。

注1:立即使用时,染料 – 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并等分多次使用。

注2:对于长期储存,染料 – 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153–0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011–E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425–E436

 

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产品名称 货号
荧光标记染料 mFluor Violet 510 酸 Cat#1141
mFluor Violet 450琥珀酰亚胺酯 Cat#1150
mFluor Violet 540琥珀酰亚胺酯 Cat#1152
mFluor Violet 500琥珀酰亚胺酯 Cat#1149

说明书
mFluor Violet 510琥珀酰亚胺酯.pdf