Cell Meter 胞内NADH / NADPH荧光成像分析试剂盒货号15290-AAT Bioquest荧光染料

发表于2023年12月24日由英国沃特曼whatman

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

Cell Meter 胞内NADH / NADPH荧光成像分析试剂盒

货号	15290	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
规格	100 Tests	价格	6564
Ex (nm)	535	Em (nm)	557
分子量		溶剂
产品详细介绍

简要概述

Cell Meter 胞内NADH / NADPH荧光成像分析试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测NADH/NADPH的试剂盒，细胞内二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH及其磷酸酯NADPH的检测对于疾病诊断和药物发现是重要的。通常，氧化还原偶联NAD / NADH和NADP / NADPH在能量代谢，糖酵解，三羧酸循环和线粒体呼吸中起关键作用。细胞中NAD（P）H水平的增加与细胞内的相关的活性氧（ROS）的异常产生和DNA损伤。然而，由于缺乏敏感的NAD（P）H探针，在生物系统中检测细胞内NAD（P）H具有挑战性。 Cell Meter™细胞内NADH / NADPH荧光成像试剂盒提供了监测活细胞中细胞内NAD（P）H水平的有效方法。 JZL1707 NAD（P）H传感器是一种优秀的荧光探针，用于检测和成像细胞中的NADH / NADPH。探针结合NADH / NADPH以产生具有高灵敏度和特异性的强荧光信号。 JZL1707 NAD（P）H传感器可以很容易地加载到活细胞中，使用Cy3®或TRITC过滤器可以方便地监测其荧光信号。该试剂盒针对荧光成像和酶标仪应用进行了优化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Cell Meter 胞内NADH / NADPH荧光成像分析试剂盒。

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适用仪器

荧光显微镜
激发：	TRITC滤波片
发射	TRITC滤波片
推荐孔板：	黑色透明

产品说明书

实验示例

概述

1.在生长培养基中制备细胞

2.将细胞与测试化合物和JZL1707 NAD（P）H传感器工作溶液在37oC孵育30-60分钟

3.将细胞洗净并保持在测定缓冲液中

4.在Ex / Em = 540/590 nm（截止波长= 570 nm）或使用TRITC滤光片的荧光显微镜下监测荧光强度（底部读取模式）

操作步骤

1.刺激NADP / NADPH，用10μL10X试验化合物（96孔板）或5μL5X试验化合物（384孔板）在无血清培养基或所需缓冲液（如PBS或HHBS）中处理细胞）。对于对照孔（未处理的细胞），加入相应量的培养基或化合物缓冲液。

注意：JZL1707 NAD（P）H传感器对血清敏感，因此建议将细胞保存在无血清培养基或您选择的缓冲液中。或者，可以在常规的全培养基中制备和处理细胞。与JZL1707 NAD（P）H传感器一起孵育时，更换为您选择的无血清培养基或缓冲液。

2.在细胞板中加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的JZL1707 NAD（P）H传感器工作溶液。将细胞与测试化合物和JZL1707 NAD（P）H传感器工作溶液在37oC共孵育30-60分钟，避光。

注意：对于NADH / NADPH阳性对照处理：将HeLa细胞与100μMNADH或NADPH在无血清培养基中孵育30分钟，并与JZL1707 NAD（P）H传感器工作溶液在37℃下共孵育30分钟。详细信息请参见图1。

3.用所需缓冲液洗涤细胞一次。移除每个孔中的溶液，并添加100μL/孔的测定缓冲液（组分B）用于96孔板或25μL/孔用于384孔板。

4.使用具有底部读取模式的Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）的酶标仪监测荧光增加，或使用荧光显微镜和Cy3过滤器或TRITC过滤器组拍摄图像。

参考文献

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124–133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416–427

Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity
Authors: Kenichi Shimada, Miki Hayano, Nen C Pagano, Brent R Stockwell
Journal: Cell chemical biology (2016): 225–235

相关产品

产品名称	货号
Cell Meter 细胞内NADH / NADPH荧光成像试剂盒深红色荧光	Cat#15295

说明书

Cell Meter 胞内NADH / NADPH荧光成像分析试剂盒.pdf

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法) 货号15260-AAT Bioquest荧光染料

发表于2023年12月24日由英国沃特曼whatman

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)

货号	15260	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
规格	400 Tests	价格	3924
Ex (nm)	575	Em (nm)
分子量		溶剂
产品详细介绍

简要概述

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（比色法）是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH，其显着提高了检测灵敏度。此外，该测定具有非常低的背景，因为其在较长波长范围内运行，这显著降低了来自生物样品的干扰。该实验证明了高灵敏度和低干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法) 货号15260

Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（100 nM）内检测少至10皮摩尔的NADP（H）。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且容易适应自动化而无需分离步骤。其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。如果需要更高的灵敏度，建议使用Cat#15259或15264。

适用仪器

光吸收酶标仪
吸收：	576 ± 5 nm
推荐孔板：	透明底板

荧光酶标仪
激发：	540nm
发射：	590nm
cutoff：	570nm
推荐孔板：	黑色孔板

产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟–2小时

监测575±5nm处的吸光度强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液中以产生10M（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和表2所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

注意：将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。高浓度的NADPH（例如，>100μM，最终浓度）可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加，以提高检测灵敏度。

注意1：对于NADP / NADPH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意2：对于基于细胞的NADP / NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。

数据分析

空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法) 货号15260

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADPH，而NADH没有响应。

参考文献

Comparative transcriptome analysis of a long-time span two-step culture process reveals a potential mechanism for astaxanthin and biomass hyper-accumulation in Haematococcus pluvialis JNU35
Authors: Luodong Huang, Baoyan Gao, Manman Wu, Feifei Wang, Chengwu Zhang
Journal: Biotechnology for Biofuels (2019): 18

相关产品

产品名称	货号
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（比色法）增强灵敏度	Cat#15276
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光	Cat#15259
Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)	Cat#15272

说明书

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法).pdf

Amplite NADPH检测试剂盒(比色法) 货号15272-AAT Bioquest荧光染料

发表于2023年8月11日由英国沃特曼whatman

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)

货号	15272	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
规格	400 Tests	价格	3264
Ex (nm)	460	Em (nm)
分子量		溶剂
产品详细介绍

简要概述

Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 NADPH探针是一种生色传感器，在NADPH减少时具有460nm的最大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite 比色NADPH检测试剂盒提供灵敏的检测方法，可在100μL检测体积中检测低至3μM的NADPH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的NADH检测试剂盒。

适用仪器

光吸收酶标仪
吸收：	460nm
推荐孔板：	透明底板

产品说明书

96孔板检测示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温孵育或15分钟至2小时

孵育460 nm处的监测吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NADPH反应混合物：

将1mL NADPH探针（组分A）加入4mL NADPH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADPH反应混合物用于一个96孔。未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将100μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的200μMNADPH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADPH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。

如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要制备细胞或组织样品。为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	…	…
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2每个孔的试剂组成

NADPH	空白对照	测试样
连续稀释：50 ul	PBS:50 ul	50 ul

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔

注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

注2：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

数据分析

空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去.NADPH标准曲线如图1所示。

Amplite NADPH检测试剂盒(比色法) 货号15272

图1使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite 比色NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。孵育30分钟（n = 3）可以检测到低至3μM的NAPDH，在460nm处测量吸光度。

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细菌细胞样品：离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

参考文献

Retinoic acid-related orphan receptor C regulates proliferation, glycolysis, and chemoresistance via the PD-L1/ITGB6/STAT3 signaling axis in bladder cancer
Authors: Ziliang Wang, Dalong Cao, Zihao Qi, Yangyang Pang, Haoran Li, Huyang Xie, Junlong Wu, Yongqiang Huang, Yao Zhu, Yijun Shen
Journal: Cancer research (2019): canres–3842

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产品名称	货号
Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光	Cat#15262
Amplite NADH检测试剂盒(比色法)	Cat#15271
Amplite 比色法黄嘌呤检测试剂盒	Cat#13842

说明书

Amplite NADPH检测试剂盒(比色法).pdf

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光货号15262-AAT Bioquest荧光染料

发表于2023年5月22日由英国沃特曼whatman

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光

货号	15262	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
规格	400 Tests	价格	3924
Ex (nm)	571	Em (nm)	585
分子量		溶剂
产品详细介绍

简要概述

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

这种Amplite 荧光NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADPH。此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了来自生物样品的干扰。

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光货号15262

Amplite 荧光NADPH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，在100μL检测体积（1μM;图1）中检测少至100皮摩尔的NADPH。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。该测定试剂盒已用于筛选使用NADP / NADPH作为辅因子的酶活性。它还被用于在基于细胞的测定中灵敏检测NADPH。与其他商业试剂盒相比，该试验具有更高的信号/背景比。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的NADPH检测试剂盒。

适用仪器

荧光酶标仪
激发：	540nm
发射	590nm
推荐孔板：	黑色孔板

产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟 – 2小时在Ex / Em = 540/590 nm处

监测荧光增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NADPH反应混合物：

将10mL Amplite™NADPH测定缓冲液（组分B）加入NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将50μLNADPH储备液（来自步骤1）加入450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到100μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL100μMNADPH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH标准品系列稀释液。

3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入到实心黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（（最佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1：平板的内容物也可以转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于基于细胞的NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。

数据分析

空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光货号15262

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。低至1μM（100pmol /孔）可以在孵育1小时（n = 3）时检测到NADPH，而NADP没有响应。

参考文献

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