2 用移液管紧贴瓶壁缓慢地将液体加 到五层细胞培养瓶中,避免产生泡 沫或者气泡(每次加液时移液管内 液体可留少许)。 注意事项:10ml 移液管可以伸到 培养瓶        底部使培养基分散开,而 25 ml 移液管则只能伸到 NEST 标志的地方把液体分散开。

3 把培养瓶有 NEST 标志那一侧朝 向自己,顺时针倾斜 45 度左右放 置一段时间,使瓶中各个隔层的液 体达到平衡。 

4 轻缓地将培养瓶水平放置于工作台 上,有耐思标志那一面朝上。

5 前后左右轻轻晃动多层瓶,液体会 均匀地分布在五个生长面上。 注意事项:摇晃的动作要轻柔,一 方面是防止起泡沫,另一方面是要 防止培养基渗漏到下层中。

6 保持跟步骤 3 中一样的姿势将多层 瓶转移至培养箱,重复步骤 4 将多 层瓶放好。 

7 抽吸法: 1抽吸的时候,将多层瓶倾斜 45 度,有 NEST 标记的一面朝向自 己。2 将移液管伸到底部抽吸培 养基,直至完全抽吸完。

8 倾倒法: 将有 NEST 标志的一面朝向自己, 逆时针 45 度倾倒液体。 注意事项:抽吸培养液时需使用 10 ml 或者 2 ml 移液管,才能将 培养液吸尽。 

9 用缓冲液清洗一遍以去除残留的血清,后加入消化液(≥ 5ml/ 层),混匀。

10 消化大约 2 min(视细胞情况而定),用消化终止液中 和消化液。

11 采用移液管抽吸法或倾倒法将细胞悬液置于离心管等容 器中。

12 用一定量的缓冲液冲洗多层瓶三次,将冲洗液同时置于 离心管中,混匀计数或者传代接种。