Screen Quest 免洗钾离子通道检测试剂盒

	货号	36552	存储条件	Multiple
	规格	100 Plates	价格	45684
	Ex (nm)	495	Em (nm)	516
	分子量		溶剂
	产品详细介绍

简要概述

钾（K⁺）离子通道在调节基本生物过程（包括心率，激素和神经递质分泌，水和电解质平衡）中起重要作用。钾离子通道已被认为是包括心律不齐，疼痛，糖尿病，神经功能障碍等在内的疾病适应症的药物靶标。Tl ⁺通过K⁺通道的渗透性已被广泛用于测定K⁺通道。表达目的K⁺通道的细胞（例如hERG，Kv1.3，Kir2.1，KATP）预先装有Tl⁺敏感染料。该染料是非荧光的，并且对细胞膜是可渗透的。进入细胞内部后，非荧光AM酯染料会被内源性酯酶裂解为留在细胞内部的带负电荷的染料。将含有低剂量Tl⁺刺激缓冲液添加到细胞中时，Tl ⁺会流过K⁺通道并与Tl⁺敏感染料结合，从而产生荧光信号。该信号与K⁺通道的活动成正比。如果将拮抗剂或拮抗剂添加至细胞，则荧光信号分别降低或升高，以反映K⁺通道的抑制或刺激活性。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Screen Quest 免洗钾离子通道检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 在生长培养基中准备细胞
2. 添加Tl-520 AM染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3. 在37°C孵育1小时
4. 加入激动剂/拮抗剂并在37°C下孵育30分钟
5. 加入Tl₂SO₄ / K₂SO₄刺激溶液（96孔板为50 µL /孔，384孔板为12.5 µL /孔）
6. 检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

1. TI-520 AM储备溶液：将20 µL（#36550）或DMSO（#36551和＃36552）的DMSO加到TI-520 AM（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：未使用的TI-520 AM储备溶液可以等分并存储在<-20℃下。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：将1 mL的10XPluronic®F127 Plus（组分B）添加到9 mL的HHBS缓冲液（组分C）中并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的10XPluronic®F127 Plus（组分B）。避光并避免重复的冻融循环。

3.无氯缓冲液（1X）：在8 mL的ddH₂O中加入2 mL的无氯缓冲液（5X）（组分D），并充分混合。

4. Tl₂SO₄溶液（未提供，Sigma Cat＃208191）：将Tl₂SO₄溶于超纯水中至终浓度80 mM。 注意：Tl₂SO₄有毒。 采取必要的预防措施，以防止吸入和皮肤接触。

 

工作溶液配制

1. TI-520 AM染料加载溶液：将20 µL TI-520 AM储备溶液（500X）加入10 mL的1X分析缓冲液中并充分混合。

2.刺激溶液（5X）：在1X无氯化物缓冲液中用Tl₂SO₄稀释配体（用于非电压门控钾通道）或K₂SO₄（用于电压门控钾通道）。

表1.应针对每个靶标优化参考（HEK293-KCNH₂细胞中的电压门控hERG通道），Tl₂SO₄和K₂SO₄（电压门控钾通道）或配体（非电压门控钾通道）的浓度及细胞类型。

组分	容积	5X 浓度	最终浓度
无氯缓冲液(5X)	2 mL
K2SO4 (250 mM)	1 mL	25 mM	5 mM
TI2SO4 (80mM)	0.5 mL	4 mM	0.8 mM
ddH2O	5.5 mL
总计:	10 mL

 

实验步骤

1.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的TI-520 AM染料加载溶液添加到细胞板中。

2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育1小时，然后在室温下再孵育15至30分钟。 注意：如果测定需要37°C，请立即进行实验，而无需进一步室温孵育。

3.用HHBS准备K⁺通道拮抗剂或激动剂。

4.在细胞培养箱中用拮抗剂（用于抑制研究）将板孵育30分钟。

5.用FLIPR，FDSS或Flexstation加50X /孔（对于96孔板）或12.5μL/孔（对于384孔板）的5X刺激缓冲液。 使用Ex / Em = 490/525 nm的滤光片组进行实验。 每1-2秒读取板3分钟。

 

图示

图1.使用Screen Quest 钾离子通道试剂盒在HEK293-KCNH2细胞中测量了对hERG通道的剂量依赖性抑制。 将细胞以20,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中接种过夜。 将细胞与100 µL染料加载溶液在37°C下孵育1小时。 向细胞中加入10 µL阿司咪唑，并在37°C下孵育30分钟。 通过FlexStation将50 µL含0.5 mM Tl2SO4和2.5 mM K2SO4的刺激溶液注入每个孔中，并在激发/发射= 490 / 525nm的情况下每秒钟读取3分钟。 IC50 = 0.46 µM。

图2.使用Screen Quest 钾离子通道试剂盒在HEK293-KCNH2细胞中测量了K2SO4剂量依赖性hERG通道活性。 将细胞以20,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中接种过夜。 将细胞与100 µL染料加载溶液在37°C下孵育1小时。 通过FlexStation将终浓度为1 mM，0.5 mM，0.25 mM或0 mM的Tl2SO4和不同浓度的含K2SO4的刺激溶液注入每个孔中，并在激发/发射= 490 /下每1-2秒读取平板3分钟。 525nm。

 

 

Screen Quest CHO-Gqs嵌合体细胞系

简要概述

产品基本信息

货号：38104

产品名称：Screen Quest CHO-Gqs嵌合体细胞系

规格：Each

产品介绍

Screen Quest 细胞系是一系列细胞，已成功用于药物发现和筛选环境中，用于研究通常不通过细胞内钙偶联的G蛋白偶联受体（GPCR）。它已与FLIPR，FDSS系统有效结合，与许多受体的非Gq偶联成员结合使用，例如趋化因子，5-羟色胺，谷氨酸，多巴胺，阿片样物质，血管加压素以及α和β-肾上腺素能受体家族。超过60％的已知G蛋白偶联受体通过Gq以外的途径发出信号，从而导致细胞内钙增加，并且随着基因组学揭示出更多的GPCR靶标，这种趋势持续增加。 Screen Quest 细胞系用于研究通常不通过细胞内钙偶联的GPCR。 Screen Quest 细胞系基于一系列G蛋白嵌合体，包括混杂的G蛋白Gα16。嵌合体由Gq蛋白复合物的α亚基组成，该复合物的5个羧基末端氨基酸已被其他G蛋白之一（Gαs，Gαi，Gαo或Gαz）取代。这些氨基酸负责受体与其G蛋白的偶联。这些嵌合体与通常通过cAMP途径起作用的特定非Gq偶联受体的共表达可能会导致受体刺激后细胞内钙信号的产生。 Screen Quest CHO-Gqs细胞系是被嵌合Gqsα亚基蛋白稳定转染的CHO-K1细胞。当用作转染Gs偶联受体表达的宿主细胞时，细胞中组成型表达的Gqs蛋白可使通常通过cAMP途径起作用的转染受体与Gq信号转导和动员的细胞内钙偶联。可以使用钙敏感染料（例如Calbryte 520 AM，Cal-520 AM，Fluo-8 AM或Fluo-4 AM）和免洗的钙试剂盒检测特定配体对这些非Gq偶联受体的激活。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Screen Quest CHO-Gqs嵌合体细胞系。 

图示

图1.用Cal-520®，AM（Cat＃21130）在CHO-Ga16-NOP细胞中测量了伤害感受肽刺激的钙反应。 将CHO-Ga16-NOP细胞以60,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中接种过夜。 在含有20 mM Hepes缓冲液（HHBS）的Hanks中，将等体积（100 µL）的10 µMCal-520®AM和2 mM丙磺舒在37°C下孵育1小时。 用具有1 mM丙磺舒的HHBS代替Cal-520®AM上样溶液。 通过FlexStation（分子设备）添加了Nociceptin，以达到最终指示的浓度。

参考文献

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cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
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A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
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Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
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Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
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