适用仪器

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞
2. 除去生长培养基
3. 加入I-Loading Buffer，用筛选化合物处理细胞
4. 用DPBS缓冲液洗涤细胞3次
5. 用1X裂解液裂解细胞
6. 添加等体积的I-sensor（50或25 µL）
7. 将0.1X加到I- Sensor Enhancer（50或25 µL）
8. 在室温下孵育10秒至10分钟
9. 检测380 nm，405 nm或630 nm处的吸光度

溶液配制

储备溶液配制

细胞裂解缓冲液（1X）：将整个小瓶的10X细胞裂解缓冲液（组分D）添加到45 mL无菌H₂O中，并充分混合。 注意：5 mL 1X细胞裂解缓冲液足以装满一块板。 将未使用的1X细胞裂解缓冲液储存在4℃。

工作溶液配制

I- Sensor Enhancer工作溶液（1X）：将50 µL 100X碘化物增强指示剂（组分B）加入5 mL无菌H₂O中并充分混合。 注意：1X I- Sensor Enhancer工作溶液不稳定，请稀释后2小时内使用。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定I-Sensor Enhancer溶液的最佳稀释度。 我们观察到0.1X I-Sensor Enhancer工作溶液在某些细胞系中效果更好。

实验步骤

1.碘化物流出测定

1.1从细胞板上吸出生长培养基。

1.2加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的预热I-上样缓冲液（组分C）并孵育2-4小时。

1.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用DPBS或HBSS清洗细胞至少3次。

1.4在HBSS缓冲液中用激动剂处理细胞5分钟。 注意：为筛选拮抗剂，将化合物与I上样缓冲液孵育至少30分钟，然后再用DPBS或HBSS缓冲液洗涤细胞。

1.5吸出上清液。

1.6通过添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。

1.7进行碘化物测定。

2.用于碘化物流入分析

2.1从细胞板上吸出生长培养基。

2.2加入预热的I-上样缓冲液（组分C）和测试化合物100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）并孵育5分钟。

2.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用HBSS洗涤细胞3次。

2.4通过添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。

2.5进行碘化物测定。

3.运行碘化物测定

3.1从碘化物流入/流出测定选择的孔中添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Iodide Blue 指示剂（组分A）。

3.2向混合物中加入50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X碘化物指示剂增强剂溶液。 注意：对于某些细胞系，您可能需要将增强剂溶液稀释至0.1X。

3.3在室温下孵育10秒-10分钟。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定最佳孵育时间。 注意：由于存在高浓度的碘化物，蓝色可能在数秒至数分钟内变为黄色。

3.4检测630、380或405 nm处的吸光度。

图示

图1. NaI剂量反应是在透明的96孔板上用Screen Quest 比色氯通道测定试剂盒测量的。

参考文献

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